当前位置: 首页 > 技术资料 > 德国ChromoTek公司GFP trap和booster实验操作说明!北京乐博生物,优势代理!
用户登录 | 注册新会员 | 您忘记密码了吗?
德国ChromoTek公司GFP trap和booster实验操作说明!北京乐博生物,优势代理!
lebo / 2015-10-12
[] [] []

德国ChromoTek公司GFP trap和booster实验操作说明!北京乐博生物,优势代理!

 

北京乐博生物联系方式:
全国免费咨询热线:4006130504
电话:010-50934026/50934036/52405563
传真:010-58850899
邮箱:info@lab-bio.com
网站:
www.lab-bio.com
地址:北京市海淀区清河三街95号同源大厦912室

 

使用 GFP-Trap®_A GFP 融合蛋白如何进行免疫沉淀实验

 

收集细胞以下以一个免疫沉淀反应使用 ~ 106-107  的哺乳动物细胞 约一个 10 厘米培养皿 达绿色荧光蛋白标记蛋白为例。收获贴壁细胞、 吸出生长培养基、 向培养皿中加入 1 毫升预冷 的 PBS 并刮取细胞。细胞转移到一个预冷却的管子 在 500 g + 4°C 时的 离心 3 分钟并丢 弃上清液。用冰的 PBS 洗两次轻轻重新悬浮细胞块的细胞团。洗涤后进入下一步

 

Lyse cells:细胞裂解 

1、用移液器或使用注射器在 200 μ l 冰冷的裂解缓冲液重悬细胞颗粒。注意 在裂解缓冲液中 加入蛋白酶抑制剂与 1 mM PMSF 用户自备。对于核/染色质蛋白可采用以下方案 使用 RIPA中加入 1mg/ml DNase, 2.5 mM MgCl2自备.

2、每充分吹打 10 分钟把管子放置在冰上 30 分钟。 

3、细胞裂解液 20.000 x g + 4 °C 离心 10 分钟。转移裂解产物到一个预冷管中。向裂解液中加入稀 释缓冲液 300ul。丢弃颗粒。 

注意 此时 细胞裂解液可以放在 -80 °C  进行长期储存。 

可选 向稀释缓冲中加入蛋白酶抑制剂与 1 mM PMSF 用户自备

Equilibrate beads平衡 beads 

4、振荡混匀 GFP-Trap®_A beads吸取 25 μ l bead  500 μ l 冰冷的稀释缓冲液中。离心 2.500 x g 2 分钟 + 4 °C。丢弃上清液和重复洗 2 次。

Bind proteins结合蛋白 

5. 将步骤 3 得到的稀释的裂解液加入到步骤 4 得到的平衡的 GFP -Trap®_A beads 中。如果需要 保存 50 ul 的稀释裂解液进行免疫印迹分析。 4°C 翻滚振荡 1 小时。 

6. 2.500 x g + 4 °C 离心 2 分钟。如果需要保存 50 ul 上清液进行免疫印迹分析。丢弃其余的上清液。 

Wash beads 清洗 beads 

7. 500 μ l 冰冷稀释缓冲液中重悬 GFP-Trap®_A beads。 在 2.500 x g + 4 °C 离心 2 分钟。丢弃 上清液和重复洗 2 次。 

optional : Increase salt concentration in the second washing step up to 500 mM. 

可选在第二次洗的步骤中增加盐的浓度到 500 mM

 

Elute proteins洗脱蛋白

 

方案一用于 western blot所有含 GFP 荧光标记的重组蛋白都会进行本步定量和鉴定实验 

8. 100 μl 2x SDS -sample buffer 中重悬 GFP -Trap ®_A beads 

9. 煮沸重悬的 GFP -Trap® _A beads 在 95°C10 min 条件下把免疫复合物从绿色荧光蛋白中游 离出来。GFP -Trap®_A beads 能通过 2.500 x g 在 4 °C 离心 2 分钟进行收集收集的产物上清 液可以进行 SDS –PAGE 

方案二用于 western blot所有含 GFP 荧光标记的重组蛋白都会进行本步定量和鉴定实验 

10. 替代步骤 8 和 9 的可选步骤 洗脱绑定的蛋白加入 50 μl 0.2M 甘氨酸 pH 值 2.5 (孵育时 30 秒,恒定混匀), 随后离心。转移上清液到新管中为了中和添加 5 μl  1 M TrispH 值10.4。为了提高洗脱效率可以重复这一步。 

方案三如需进行检测 GFP-融合酶的活性检测无需洗脱单独可以直接检测。 

方案四如要进行 CHIP 实验主要用于含有 GFP 荧光的重组蛋白的蛋白质/DNA 相互作用的实验。 染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定染色质断裂染色质免疫沉淀交联反应的逆转DNA的纯化以及 DNA 的鉴定。其中第一步细胞固定染色质断裂不变染色质免疫沉淀则直接进 入说明书的第 5 步加入的是 DNA-蛋白复合物结合到 GFP -Trap ®_A beads。进入第 6 步第 7分离得到复合物进入第 10 步得到洗脱的复合物后期交联反应的逆转DNA 的纯化以 及 DNA 的鉴定同普通的 CHIP 实验。 

方案五pulldown 实验: 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。用于验证两个已知蛋白的相互 作用或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。两个已知蛋白的相互作用一个蛋白是 GFP 融 合蛋白另一个蛋白为 FLAG 标签的融合蛋白在第 5 步同时加入两者其他步骤不变。进入第 10 得到洗脱的复合物同时进行 GFP  FLAG  western blot 实验。筛选与已知蛋白相互作 用的未知蛋白操作同免疫沉淀法第 10 步得到洗脱的复合物然后进行后期质谱检测。 

方案五Co-IP 实验: 体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。当细胞在非变性条件下被裂解时完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。用于验证两个已知蛋白的相互 作用或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。采用免疫沉淀对象蛋白为 GFP-目的蛋白结合 的融合蛋白与之相结合的蛋白质 Y 也被沉淀下来从而达到吸附蛋白质-蛋白质复合物的目的。 沉淀下来的蛋白质复合物采用 SDS-Page 跑胶western blot 进行鉴定也可以选择用得到的样品利用质谱进行后续分析。

 

 

GFP Booster 实验操作 

1.固定 接种于盖玻片的细胞用的 3.7%甲醛溶于 PBS固定室温下 10 分钟。 

2. 用含有 0.1%吐温 20 的 PBS (PBST)清洗样品三次。 

3.穿透 添加含 0.5%的 Triton X 100 PBS到样品并温育 5 分钟室温下。或者通透细胞 在 100%甲醇中温育样品 5 分钟--20°C 

4.用 PBST 清洗样品两次。 

5.封闭 PBST 中添加 4 % BSA 加入到样品中室温温育 10 分钟。 

6. GFP-Booster 温育 blocking 缓冲液中加入 200 倍稀释的 GFP-Booster室温温育 1 小时。 

7.用 PBST 清洗样品三次每次洗 5-10min。 8.如果需要的话用 DNA 荧光染料染色如 DAPI 

9.安装在水中快速冲洗样品以防止盐晶体的形成。按照盖玻片。经荧光抗体染色的标本需要 在荧光显微镜下观察。最好在染色当天即作镜检以防荧光消退影响结果。

 

 

 

北京乐博生物联系方式:
全国免费咨询热线:4006130504
电话:010-50934026/50934036/52405563
传真:010-58850899
邮箱:info@lab-bio.com
网站:
www.lab-bio.com
地址:北京市海淀区清河三街95号同源大厦912室

 

用户评论

  • 暂时还没有任何用户评论
用户名: 匿名用户
E-mail:
评价等级:
评论内容:
验证码: captcha

相关商品

浏览历史

                                                                                                                                    企业QQ客服: QQ客服销售
                                 全国免费热线:400-613-0504     办公电话:010-50934026/50934036/52482803/52405563     传真:010-58850899     服务投诉邮箱:info@lab-bio.com
                                           QQ企业公众号:可搜索并关注”乐博生物”,也可以扫一扫右侧二维码                         微信企业公众号:可搜索并关注”乐博生物”,也可以扫一扫右侧二维码